Vai al Gruppo Taccone

CGH Array

La tecnica definita Microarray viene utilizzata per individuare GENI DIFFERENZIALMENTE ESPRESSI in cellule eucariotiche in diverse condizioni sperimentali. Tecnicamente si prevede l’utilizzo di supporti solidi sui quali sono stati immobilizzati campioni di DNA corrispondenti a centinaia di GENI noti e non noti. Vengono poi preparate, da cellule trattate in modo diverso, dell’ m-RNA (espressione dei geni cellulari) e marcato con traccianti radioattivi o luminescenti. Queste miscele sono poi incubate con il DNA dei geni immobilizzati e laddove sarà presente RNA e DNA complementare avverrà il riconoscimento e l’appaiamento delle due molecole. In tal modo, confrontando il segnale proveniente da uno stesso gene nelle diverse condizioni sperimentali, si può valutare se quel gene ha subito una variazione quantitativa di espressione. Considerato l’alto numero di geni che si possono immobilizzare sui supporti solidi e quindi analizzabili, si può comprendere la potenza di questa tecnica. In un solo esperimento si possono identificare centinaia di geni coinvolti in numerose funzioni cellulari.
Il Microarray rappresenta una tecnica complessa e delicata che necessita di alta tecnologia.
E’ più che mai importante essere dotati di strumenti e reagenti di alta qualità.

La CGH (Comparative Genomic Hybridization) convenzionale è una tecnica che è stata sviluppata per rilevare variazioni del numero di coppie di geni specialmente in campioni oncologici, per i quali era difficile ottenere metafasi con risoluzione di bandeggio accettabile. Il principio della tecnica si basa su una competizione per il legame su un supporto normale (cromosomi in metafase) di 2 DNA genomici marcati con fluorocromi diversi. Un DNA è estratto dal paziente in esame mentre l'altro è un pool di DNA genomico di riferimento.
Il vantaggio di tale tecnica è che in un'unica ibridazione si possono ottenere informazioni sulla dimensione e sulla localizzazione di tutti gli sbilanciamenti cromosomici. Tuttavia la CGH tradizionale presenta alcuni problemi, tra cui la variabilità della morfologia dei cromosomi, che ne limitano la risoluzione a circa 5-10 Mb per le delezioni e 2Mb per le amplificazioni. Inoltre è una tecnica piuttosto laboriosa.


L'array CGH è stato sviluppato sostituendo i cromosomi delle metafasi di riferimento con una matrice su cui sono spottati cloni BAC o PAC di circa 150 Kb, corrispondenti a loci specifici del cromosoma. L'utilizzo di tali cloni permette l'immediata correlazione tra l'eventuale alterazione e una precisa posizione nel genoma, la risoluzione genomica dipende quindi dalla lunghezza dei cloni utilizzati e dalla distanza tra un clone e l'altro.

Array -CGH Genomico
IntegraChipTM è un DNA micro- array ad alta densità costituito da 3200 cloni BAC non sovrapposti (tutti validati in FISH per escludere cloni con segnali aspecifici) spottati su un chip di silicio in quadruplicato in 2 aree separate. Questi cloni rappresentano regioni specifiche di tutti i cromosomi umani e coprono l’intero genoma con una risoluzione di 0,8 Mb.


Caratteristiche e vantaggi
3200 cloni BAC tutti validati consentono un’elevata risoluzione per individuare delezioni o duplicazioni di piccole dimensioni.

Continuo aggiornamento del numero e della qualità dei cloni BAC:
- Procedure interne di controllo per l’eliminazione di cloni polimorfici. Questi vengono sostituiti con nuovi cloni non polimorfici che mappano nella stessa regione; - Aggiunta periodica di nuovi cloni per raggiungere una risoluzione sempre più alta;
- I nuovi cloni sono selezionati e validati da più laboratori prima di essere inseriti nel chip.

Spot di controllo che includono pool di BAC umani come controllo positivo e DNA di riso come controllo negativo.

Rapporto ottimale segnale/fondo per avere immagini di qualità superiore.

Notevole risparmio di tempo e lavoro rispetto le metodiche tradizionali.

Barcode unico per ogni Chip per facilitare la gestione dei dati ed evitare la possibilità di errore. Il barcone può essere utilizzato con scanner con lettore di barcode.

Dye Swap non necessario grazie agli spot in quadruplicato. E’ possibile quindi usare un solo vetrino per determinazione anzichè due, diminuendo così i costi, soprattutto negli studi in cui si vogliano studiare/confrontare numerosi DNA diversi.

Controlli di qualità eseguiti su singolo vetrino e su ogni batch di vetrini.
Questi controlli comprendono:
- Colorazione con Sybgreen per testare l’omogeneità degli spot;
- Autofluorescenza per valutare l’uniformità dell’adesione del DNA al supporto.

Telomeric CGH Array
Il Telomeric CGH Array Technogenetics è un chip che permette l’analisi simultanea di tutte le regioni telomeriche mediante una singola ibridazione.


Caratteristiche e Vantaggi
Ogni telomero e' rappresentato da 3 cloni. Ogni cromosoma e' rappresentato da almeno 2 cloni di controllo 1 in p e 1 in q. Tutti i cloni sono stati validati per FISH per escludere quei cloni con segnali aspecifici.
I cloni sono spottati in 3 copie per una migliore riproducibilita' dei dati ed affidabilita' della metodica. Sullo stesso vetrino sono presenti due aree di ibridazione per gli esperimenti in dye-swap.
L'array contiene, oltre ai cloni di controllo per tutti i cromosomi, cloni di controllo positivi (pool di BAC umani) e negativi (DNA di riso).
Alta risoluzione per avere dati affidabili e sicuri.
Facilità d’utilizzo e costi contenuti per risparmiare tempo e denaro.

MIcro Deletion Telomeric - CGH Array
Il MDelTel-CGH array Technogenetics è un array per la diagnostica pre e post natale costituito da cloni che coprono le regioni critiche interessate da microdelezioni associate a un gran numero di sindromi. Nel chip inoltre sono compresi cloni per le regioni subtelomeriche. Questo array permette l’analisi simultanea di tutte queste regioni mediante singola ibridazione.


Caratteristiche
Ogni chip contiene 400 cloni.
Ogni regione subtelomerica è rappresentata da 3 cloni.
Cloni per sindromi da microdelezione.
Ogni cromosoma ha un clone di controllo sia per il braccio lungo q che per il braccio corto p.
Tutti i cloni sono stati validati per FISH per escludere i cloni con segnali aspecifici.
Cloni di Controllo Positivi (pool di BAC umani) e Negativi (DNA riso).
Sullo stesso vetrino sono presenti due aree di ibridazione per gli esperimenti in dye-swap.
Alta risoluzione per ottenere dati affidabili e sicuri.
Facilità d’utilizzo e costi contenuti per risparmiare tempo e denaro.
Consente di valutare anche le duplicazioni telomeriche.